光学显微镜
现代光学显微镜的兴起
直到1644年,在贾姆巴蒂斯塔·欧迪纳的《德拉·莫斯卡的光之眼》中,才出现了第一个基于显微镜的有机组织显微解剖的详细描述。
直到16世纪60年代和70年代,显微镜在很大程度上仍然是一种新事物,意大利、荷兰和英国的博物学家开始用显微镜研究生物学。意大利科学家马尔切洛·马尔皮吉,被一些生物学历史学家称为组织学之父,他开始了对肺部生物结构的分析。罗伯特·胡克的《微生物学》产生了巨大的影响,主要是因为它令人印象深刻的插图。安东尼·范·列文虎克也做出了重大贡献,他用简单的单透镜显微镜实现了300倍的放大,把一个非常小的玻璃球透镜夹在铆接在一起的两块金属板的孔之间,并用一个可调节的螺丝针固定样本。 然后,范·列文虎克重新发现了红细胞(在简·斯瓦默达姆之后)和精子,并帮助普及了显微镜观察生物超微结构的应用方法。1676年10月9日,范·列文虎克报道了微生物的发现。
光学显微镜的性能取决于聚光透镜系统的质量和正确使用,聚光透镜系统将光聚焦在样本上,物镜系统用于捕获来自样本的光并形成图像。 早期的仪器受到许多限制,直到19世纪末20世纪初电灯成为光源,这一原理得到了充分的重视与发展。1893年8月,柯勒提出了样品照明的关键原理——柯勒照明,这是达到光学显微镜分辨率理论极限的关键。这种样本照明方法产生均匀的光线,并克服了早期样本照明技术所带来的有限对比度和分辨率。样品照明的进一步发展来自于弗里茨·塞尔尼克在1953年发现的相位对比度,以及乔治·诺曼斯基在1955年发现的差分干涉对比度照明;两者都允许对未染色的透明样品成像。
电子显微镜
在20世纪早期,光显微镜的一个重要替代物被开发出来,这是一种使用电子束而不是光来产生图像的仪器。德国物理学家恩斯特·罗斯卡(Ernst Ruska)与电气工程师马克斯·诺尔(Max Knoll)合作,于1931年开发了第一台原型电子显微镜——透射电子显微镜。透射电子显微镜的工作原理与光学显微镜相似,但是用电子代替光,用电磁铁代替玻璃透镜。使用电子而不是光,可以获得更高的分辨率。
透射电子显微镜是在1935年由马克斯·诺尔(Max Knoll)开发的扫描电子显微镜之后迅速发展起来的。 虽然透射电子显微镜在二战前已被用于研究,并在二战后开始变得流行,但扫描电子显微镜直到1965年才开始商业化。
透射电子显微镜在第二次世界大战后变得流行起来。在西门子工作的恩斯特·罗斯卡(Ernst Ruska)开发了第一台商用透射电子显微镜,并在20世纪50年代开始举行关于电子显微镜的重大科学会议。1965年,查尔斯·奥茨利爵士和他的研究生加里·斯图尔特(Gary Stewart)开发了第一台商用扫描电子显微镜,剑桥仪器公司将其销售为“立体扫描仪”。
关于使用电子显微镜的最新发现之一是其识别病毒的能力。 由于这种显微镜能产生可见、清晰的小细胞器图像,因此在电子显微镜中不需要试剂就可观察病毒或有害细胞,从而更有效地检测病原体。
扫描探针显微镜
1981年到1983年间,格尔德·宾宁和海因里希·罗雷尔在瑞士苏黎士的国际商用机器公司研究量子隧道现象。他们发明了一种实用的仪器:一种基于量子隧道理论的扫描探针显微镜,利用它可以读取探针和样品表面之间非常小的相互作用力。由于探针非常接近表面,电子可以在探针和样品之间连续流动从而产生从样品表面到探针的电流。由于基础理论的复杂性,显微镜最初并没有得到广泛接受。1984年,杰瑞·特索夫和戴德·哈曼在新泽西默里山的AT&T贝尔实验室发表文章,将理论与仪器获得的实验结果联系起来。紧接着,1985年,功能性商用仪器问世,1986年,格尔德·宾宁、夸特和戈贝尔发明了原子力显微镜,随后宾尼格和罗勒因为SPM而获得了诺贝尔物理学奖。
随着加工超细探针和针尖能力的提高,新型扫描探针显微镜不断发展。
荧光显微镜
光学显微镜的最新发展主要集中在生物学中荧光显微镜的兴起。 在20世纪最后几十年,特别是在后基因组时代,发展了许多细胞结构荧光染色技术。 主要的技术组包括特定细胞结构的靶向化学染色,例如,用化合物DAPI标记DNA,与荧光报道基因结合的抗体的应用,例如免疫荧光,以及荧光蛋白,如绿色荧光蛋白。 这些技术使用不同的荧光团在分子水平上分析活样品和固定样品的细胞结构。
荧光显微镜的兴起推动了一种主要的现代显微镜——共焦显微镜的发展。该原理于1957年获得马文·明斯基专利,尽管激光技术限制了该技术的实际应用,直到1978年,托马斯和克里斯托弗·克雷默才开发出第一台实用的共焦激光扫描显微镜,这项技术在20世纪80年代迅速普及。
超分辨率显微镜
目前许多关于光学显微镜技术的研究(在21世纪早期)集中在荧光标记样品的超分辨率分析的发展上。结构照明可以将分辨率提高大约2到4倍,像受激发射损耗(STED)显微镜技术正在接近电子显微镜的分辨率, 这是因为衍射极限来自于光或由激发产生,使得分辨率必须加倍才能达到超饱和。斯特凡·赫尔和埃里克·白兹格、威廉·摩尔纳因STED对技术发展的贡献获得了2014年诺贝尔化学奖,他们将荧光显微镜用于单分子可视化。
x光显微镜
x光显微镜是使用电磁辐射的仪器,通常在软x光波段对物体成像。20世纪70年代早期,x光透镜光学技术的进步使该仪器成为可行的成像选择。 它们经常被用于断层摄影(见微型计算机断层摄影),以产生物体的三维图像,包括尚未化学固定的生物材料。目前关于改善具有更大穿透力的硬x光的光学性能的研究正在进行中。
广角光学显微镜和透射电子显微镜都使用透镜理论(光学显微镜和电磁透镜),以放大透射通过样品或被样品反射的波所产生的图像,使用的波是电磁波(在光学显微镜中)或电子束(在电子显微镜中)。这些显微镜的分辨率受到对样品成像的辐射波长的限制,较短的波长可以获得较高的分辨率。
像共焦显微镜和扫描电子显微镜一样,扫描光学显微镜和电子显微镜使用透镜将光点或电子聚焦到样品上,然后分析光束与样品相互作用产生的信号。然后在样本上扫描该点,以分析某个矩形区域。图像的放大是通过在相对较大的屏幕上显示扫描较小的样本区域来实现的。这些显微镜具有与宽视场光学显微镜、探针显微镜和电子显微镜相同的分辨率极限。
扫描探针显微镜也分析样品中的一个点,然后在矩形样品区域上扫描探针以建立图像。由于这些显微镜不使用电磁或电子辐射成像,因此它们不受与上述与光学和电子显微镜类似的分辨率限制。
光学的
最常见的显微镜类型(也是最早发明的)是光学显微镜。这是一种包含一个或多个透镜的光学仪器,可以产生放置在焦平面上的样品的放大图像。光学显微镜有折射玻璃(偶尔有塑料或石英),用来将光线聚焦在眼睛上或另一个光检测器上。基于镜子的光学显微镜以同样的方式工作。假设可见光范围,光学显微镜的典型放大倍数高达1250倍,理论分辨率极限约为0.250微米或250纳米。 这将实际放大倍数限制在1500倍左右。专业技术(如扫描共聚焦显微镜、垂直扫描显微镜)可能会超过此放大倍数,但分辨率受到衍射限制。使用较短波长的光,如紫外线,是提高光学显微镜空间分辨率的一种方法,近场扫描光学显微镜也是如此。
Sarfus是一种最新的光学技术,它将标准光学显微镜的灵敏度提高到可以直接观察纳米薄膜(低至0.3纳米)和孤立纳米物体(低至2纳米直径)的程度。该技术基于交叉偏振反射光显微镜使用非反射基底。
紫外光能够分辨微观特征,并对肉眼透明的样品成像。近红外光可用于显现嵌入键合硅器件中的电路,因为硅在该波长范围内是透明的。
在荧光显微术中,从紫外线到可见光的许多波长的光可以用来使样品发出荧光,并用眼睛或特别敏感的照相机观察。
与相差显微镜(右)相比,典型明视野(左)观察到的未染色细胞。
相衬显微镜”是一种光学显微镜照明技术,其中穿过透明样品的光的小相移被转换成图像中的振幅或对比度变化。 使用相差不需要染色来观察载玻片。这种显微镜技术使得研究活细胞的细胞周期成为可能。
传统的光学显微镜最近演变成了数字显微镜。并非通过目镜直接观察物体,而是使用一种类似于数码相机中使用的传感器来获得图像,然后将图像显示在计算机监视器上,代替目镜直接观察物体。根据应用,这些传感器可以使用互补金属氧化物半导体(CMOS)或电荷耦合器件(CCD)技术。
使用灵敏的光子计数数码相机,可以获得光线水平非常低的数字显微镜,以避免对脆弱的生物样本造成损害。已经证明,提供成对纠缠光子的光源可以最小化对最光敏样品的损坏风险。在将重影成像应用于光子稀疏显微术中,样品被红外光子照射,每个光子与可见光波段的纠缠伙伴在空间上相关联,以便通过光子计数照相机进行有效成像。
电子的
两种主要类型的电子显微镜是透射电子显微镜(TEMs)和扫描电子显微镜(SEMs)。 它们都有一系列电磁和静电透镜,可以将高能电子束聚焦在样品上。在透射电镜中,电子穿过样品,类似于基本的光学显微镜。 这需要仔细准备样品,因为电子被大多数材料强烈散射。样品必须非常薄(50-100纳米),电子才能通过。 用锇和重金属染色的细胞横截面显示出透明的细胞器膜和蛋白质,如核糖体。 分辨率为0.1纳米,可以获得病毒的详细视图(20-300纳米)和一条脱氧核糖核酸链(2纳米宽)。 相比之下,扫描电镜有光栅线圈,用细电子束扫描大块物体的表面。因此,样品不一定需要切片,但需要涂上重金属等物质。 这可以体现样品表面的三维视图像。
扫描探针
不同类型的扫描探针显微镜是由许多不同类型的相互作用产生的,这些相互作用发生在小探针被扫描并与样本相互作用时。这些相互作用或模式可以被记录或映射为表面位移的函数,以形成表征图。三种最常见的扫描探针显微镜是原子力显微镜、近场扫描光学显微镜(MSOM或SNOM,扫描近场光学显微镜)和扫描隧道显微镜。 原子力显微镜有一个细探针,通常是硅或氮化硅,附着在悬臂上;探头在样品表面上扫描,测量并绘制引起探针和样品表面相互作用的力。近场扫描光学显微镜类似于原子力显微镜,但它的探头由光纤中的光源组成,光纤顶端通常有一个供光线通过的孔。显微镜可以捕捉透射光或反射光,以测量表面非常局部的光学特性,通常是生物样本的表面。扫描隧道显微镜的金属尖端只有一个顶端原子;探针针尖连接到电流流经的通道上。 使用针尖在导电样品表面上扫描,直到隧道电流流动;探针连接的计算机维持电流保持恒定,并且通过记录探针针尖的运动形成图像。
其他类型
扫描声学显微镜使用声波来测量声阻抗的变化。原则上与声纳相似,它们用于探测材料子表面的缺陷,包括集成电路中的缺陷。2013年2月4日,澳大利亚工程师建造了一台“量子显微镜”,提供无与伦比的精度。
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